超分辨率荧光显微镜的重大进展

由诺贝尔奖获得者Stefan Hell在海德堡马克斯普朗克医学研究所领导的科学家开发了一种超分辨率显微镜，其时空精度为每毫秒一纳米。他们最近推出的MINFLUX超分辨率显微镜的改进版本允许以前所未有的细节水平观察单个蛋白质的微小运动：运动蛋白驱动蛋白-1在消耗ATP时沿着微管行走时的步进运动。这项工作发表在《科学》杂志上，强调了MINFLUX作为观察蛋白质纳米尺寸构象变化的革命性新工具的力量。

解开细胞的内部运作需要了解单个蛋白质的生物化学。测量它们位置和形状的微小变化是这里的核心挑战。荧光显微镜，特别是超分辨率显微镜(即纳米显微镜)在这一新兴领域已成为不可或缺的。最近推出的荧光纳米系统MINFLUX已经达到了一到几纳米的空间分辨率 - 有机小分子的大小。但是，将我们对分子细胞生理学的理解提升到一个新的水平需要以更高的时空分辨率进行观察。

当Stefan Hell的小组在2016年首次提出MINFLUX时，它已被用于追踪细胞中的荧光标记蛋白。然而，这些运动是随机的，跟踪的精度为数十纳米。他们的研究是第一个将MINFLUX的分辨能力应用于蛋白质的构象变化，特别是运动蛋白驱动蛋白-1。为此，马克斯普朗克医学研究所的研究人员开发了一种新的MINFLUX版本，用于跟踪单个荧光分子。

所有已建立的测量蛋白质动力学的方法都有严重的局限性，阻碍了它们解决至关重要的(亚)纳米/(亚)毫秒范围的能力。有些提供低至几纳米的高空间分辨率，但不能足够快地跟踪变化。其他具有较高的时间分辨率，但需要使用比正在研究的蛋白质大2至3个数量级的磁珠进行标记。由于这种大小的珠子可能会损害蛋白质的功能，因此使用珠子的研究留下了悬而未决的问题。

来自单个分子的荧光

然而，MINFLUX只需要一个标准的1nm大小的荧光分子作为附着在蛋白质上的标记，因此可以提供研究天然蛋白质动力学所需的分辨率和最小侵入性。“一个挑战在于构建一个接近理论极限并屏蔽环境噪声的MINFLUX显微镜，”该小组的博士生Otto Wolff说。“设计不影响蛋白质功能但仍能揭示生物学机制的探针是另一回事，”他的同事Lukas Scheiderer补充道。

研究人员现在引入的MINFLUX显微镜可以记录蛋白质运动，时空精度高达每毫秒1.7纳米。它只需要检测荧光分子发射的约20个光子。“我认为我们正在研究单个蛋白质的动力学以及它们在功能过程中如何改变形状，”Stefan Hell说。“MINFLUX提供的高空间和时间分辨率的结合将使研究人员能够以前所未有的方式研究生物分子。

ATP驱动蛋白-1在生理条件下解析步进运动

驱动蛋白-1是在整个细胞中运输货物的关键参与者，蛋白质的突变是几种疾病的核心。Kinesin-1实际上沿着细丝(微管)“行走”，这些细丝(微管)像街道网络一样跨越我们的细胞。人们可以将这种运动想象成字面上的“步进”，因为蛋白质有两个“头”，它们交替改变它们在微管上的位置。这种运动通常沿着形成微管的13个原丝之一发生，并通过细胞的主要能量供应商ATP(三磷酸腺苷)的分裂来推动。

科学家们仅使用单个荧光团标记驱动蛋白-1，记录了单个头部的常规16 nm步长以及8 nm子步长，具有纳米/毫秒的时空分辨率。他们的结果证明，当单个头部与微管结合时，ATP被吸收，但是当两个头部都结合时，ATP水解就会发生。它还揭示了步进涉及蛋白质“茎”的旋转，这是驱动蛋白分子中容纳货物的部分。MINFLUX的时空分辨率还揭示了每个步骤初始阶段头部的旋转。值得注意的是，这些发现是使用ATP的生理浓度进行的，这是迄今为止使用微小荧光标记无法实现的。

“我很兴奋，所以看看MINFLUX将带我们去哪里。它为蛋白质如何工作的研究增加了另一个维度。这可以帮助我们了解许多疾病背后的机制，并最终有助于治疗的发展，“Jessica Matthias补充道，她是一名博士后科学家，曾在Hell's Group工作，现在正在探索MINFLUX在各种生物学问题中的应用。